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酵母多代数接种是否导致酵母细胞衰老

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撬啤精酿-V 发表于 2020-6-5 23:47:04 | 显示全部楼层 |阅读模式 打印 上一主题 下一主题
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在啤酒发酵结束时对酵母泥进行回收,然后接种到下一批次的发酵中,称之为酵母回收接种,每发酵一个批次,酵母称为“1代”。在啤酒生产过程中应用酵母回收接种可以有效的节省时间和资源,即节省生产成本。然而,对于工业啤酒生产来说为了生产高质量的啤酒年轻的和生理功能稳定的酵母细胞是必须的,同时尽量避免使用过多代数的酵母(一般只用“5代”)。诸多研究报道显示酵母多代数接种能够导致酵母细胞质量退化和发酵性能降低。相反的,对多代数接种酵母细胞中的基因表达情况进行检测,结果发现标识基因的表达非常稳定。研究人员发现Lager酵母经过135代接种后与新鲜酵母没有显示出显著差异。

然而,需要确认,假定酵母多次传代能够导致发酵性能降低,如果是这样的话相关的机理又是什么呢?发酵性能降低的原因可能是由于衰老的或死细胞的积累。啤酒酵母细胞可以通过出芽的方式进行繁殖,酵母细胞一生能够繁殖20-50新细胞,每生一个新细胞会在酵母细胞表面形成一个芽痕(图1),因此,酵母细胞表面芽痕越多酵母越加衰老,此衰老过程称为复制衰老。酵母细胞达到最大的繁殖数目后,细胞将失去繁殖能力,并逐渐衰老最终死亡。

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图1 啤酒酵母细胞芽痕扫描

因此,本文主要分析在三个酿造厂和不同的环境条件下同一个酿造酵母(Saccharomyces pastorianus HEBRU)多代数接种细胞是否会逐渐衰老。因此,细胞衰老、细胞出芽数、细胞大小、DNA含量和标识基因表达状态被分析。并且,沉淀于发酵罐锥体中酵母细胞的生理状态是否均匀也被分析。

(一)在多次传代接种过程中复制衰老和细胞体积的变化

本文对从三个酿造厂发酵罐锥体获取100酵母细胞,并对不同代数条件下衰老和生理状态相关指标进行分析,结果见图2。

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图2 不同代数条件下酵母细胞的芽痕数、G1期或G2期细胞数、新细胞数和细胞体积

由图2结果可知,在酿造厂A和B中对酵母进行6次传代接种,6代酵母细胞的各项指标基本保持不变,其中絮凝酵母泥中未发芽的酵母细胞(新细胞)占半数以上,并且绝大部分细胞繁殖小于5个芽痕,只有极少不是细胞具有10个以上的芽痕。在酿造厂C中对酵母进行17代接种,与酿造厂A和B相似,酵母细胞并未随代数的增加而使絮凝酵母泥中衰老的酵母细胞数目增加,仍然保持大部分是活力较高的年轻酵母细胞。结果发现酵母传代次数与出5个以上芽的细胞数目和细胞出芽数均不相关。由此可知,酵母传代次数不会影响细胞出芽能力。另外,稳定的细胞恢复率(新细胞数/出过芽细胞)大约保持在1(酿造厂A为1.05;酿造厂B为1.07和酿造厂C为0.87)被发现。

复制衰老(出芽数)与细胞体积显著正相关。在三个酿造厂多次传代接种过程中细胞出芽越多细胞体积就越大。酿造厂B和C中酵母细胞体积分别为7.05μm和7.06μm显著小于酿造厂A中酵母细胞体积(7.47μm)。分析三个酿造厂每个批次发酵结束时新细胞的数目与麦汁溶氧量呈现正相关。因此,对于细胞繁殖来说麦汁提高通氧量是必须的。(酿造厂A麦汁溶氧量为39mg/L;酿造厂B麦汁溶氧量为25mg/L和酿造厂C麦汁溶氧量为11mg/L)。

(二)DNA含量和细胞周期状态

细胞繁殖周期可分为G1期表示无氧生产乙醇状态的细胞;G2期表示繁殖状态的细胞。每个批次发酵结束时G1期状态的细胞数目保持不变。在酿造厂A中G1期细胞为91%;酿造厂B中G1期细胞为80%;酿造厂C中G1期细胞为83%。

(三)基因表达数据

本文对从三个酿造厂发酵罐锥底获取100酵母细胞,并对不同代数条件下衰老和耐受压力相关基因的表达情况进行分析,结果见图3。

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图3 不同代数条件下酵母细胞的衰老、细胞凋亡、自噬、耐压、端粒、染色体和DNA修复、海藻糖和糖原相关基因表达情况

由图3结果可知,在酿造厂A和B中对酵母进行6次传代接种,6代酵母细胞的衰老相关基因基本保持不变。在酿造厂C中对酵母进行17代接种,其前6代酵母细胞的衰老相关基因基本保持不变。然而从第7代到17代,酵母细胞中海藻糖和糖原相关基因的表达现在提高。海藻糖和糖原在酵母细胞中主要提高细胞耐受环境压力(厌氧、渗透压和乙醇)。这可能是由于酿造厂C的酿造麦汁溶氧量较低引起的,在厌氧环境压力下酵母细胞多次传代接种为保持自身生理活性因此在保内积累海藻糖和糖原,这一调控势必会改变酵母细胞内代谢状态进而影响酵母发酵性能和风味形成。

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图4 不同代数条件下酵母的主成分分析

运用PCA主成分分析酿造厂A、B和C相关基因表达情况(图4),结果表明三个酿造厂均在自己的区域,即三者虽然是相同的酵母菌但因为发酵条件的差异导致其衰老和耐受压力的基因会出现不同的区域。其中,酿造厂C的区域较大表明多次传代接种对其基因表达影响较大。也就是溶氧不足会显著的导致多次传代接种后细胞衰老。因此,如要克服这种不利的影响需要为发酵麦汁进行充分的通氧。

(四)发酵罐锥部取样分析

本文对酿造厂A和C传代6次以后对发酵罐锥底不同位置不同酵母细胞衰老情况进行检测(图4)。

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图5发酵罐锥底酵母细胞的G1期或G2期细胞数、未发芽细胞数、活细胞或死细胞数和细胞体积

由图3可知,从发酵罐锥底顶部到底部活细胞数目保持一致,均在95%以上,并且以G1期为主。但是,未发芽酵母细胞数逐渐减低,从大约70%降到50%。细胞体积逐渐增加。这一结果说明底部酵母比顶部酵母更加衰老,也就是较衰老的酵母先絮凝下来,越年轻的酵母越后絮凝。因此,在发酵结束时可以对发酵罐锥底中上部酵母进行回收进行传代接种。

结论

多次传代接种并未导致三个酿造厂的酿酒酵母(Saccharomyces pastorianus HEBRU)复制衰老。并且,多次传代接种后始终保持稳定的稳定的细胞恢复率(新细胞数/出过芽细胞)。酿酒酵母新细胞的数目取决于麦汁的溶氧量。在三个酿造厂中提高的通氧量对于酵母保持活力是有利的,甚至酵母可以应用7代以上。另外,在发酵结束时可以对发酵罐锥底中上部酵母进行回收进行传代接种。
——我不是懒,我只是懒得签名而已。PS:汽泡菌
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